双荧光素酶报告基因系统是一项在生物医疗领域广泛应用的技术，主要用于研究基因表达调控、蛋白质相互作用和信号通路。这项技术始于1990年，经过30多年的发展，已成为重要的实验工具。1993年，第一个萤光素酶专利获得批准，1996年推出双荧光素酶报告基因检测系统，之后迅速传播并应用于多种研究。

该系统通常结合两种不同来源的荧光素酶，最常用的是来自北美火虫（Photinus pyralis）的荧光素酶和来自海洋腔肠动物海肾（Renilla reniformis）的荧光素酶。其中，前者编码550个氨基酸，分子量为62kDa，是一个能够无需后修饰而直接具备可检测酶活性的单体酶(张菊梅等, 2001)。而后者则是36kDa的单亚基特异活性蛋白，完成转录翻译后同样具备催化活性(赵斯斯, 2012)。

实验原理

该实验利用荧光素酶与底物结合后发生化学发光反应的特性，将感兴趣基因的转录调控元件克隆在萤火虫荧光素酶基因的上下游，从而构建荧光素酶报告质粒。通过转染细胞并适当刺激后裂解细胞，随后测定荧光素酶活性，以荧光值的高低判断不同刺激对感兴趣调控元件的影响。同时，使用Renilla荧光素酶的报告基因质粒作为内参，可以校正不同组别之间的细胞生长状况、细胞数目及转染效率差异，确保实验数据的可靠性。

实验步骤

1. 报告基因质粒构建：将目的片段插入荧光素酶表达的报告基因载体中。

2. 转染细胞：共同转染报告基因质粒与内参质粒至细胞，通常持续48小时。

3. 细胞处理：根据实验设计，对细胞进行特定处理。

4. 裂解细胞：加入裂解液裂解细胞。

5. 测定荧光值：加入底物荧光素，测定萤火虫荧光素酶与海肾荧光素酶的荧光值。

6. 数据处理：计算相对荧光素酶活性，并进行统计分析（如t检验或ANOVA），评估各组间差异的显著性。

应用场景

双荧光素酶报告基因系统有多种应用，主要包括：

• miRNA与靶基因的靶向互作研究：验证miRNA与mRNA、lncRNA及cirRNA的相互作用；探索CeRNA机制。
• 转录因子与启动子的相互作用：研究转录因子对基因表达的调控作用。
• 启动子活性分析：验证启动子的表达模式及强度。
• 启动子SNP分析：利用该系统分析一些基因启动区的单核苷酸多态性相对活性。
• 研究细胞内信号通路的激活与传导：将特定信号通路的下游响应元件克隆至报告基因载体，再通过不同上游条件下荧光素酶活性的变化进行评估。
• 药物筛选：用于高通量药物筛选，评估药物对基因表达的影响。

常见问题与解决方法

Q1：实验结果荧光值过高？
可能超出仪器检测范围，建议减少质粒转染量或对裂解产物进行稀释来确保检测范围。

Q2：实验结果不稳定或孔间差异大？
检查细胞状态、优化转染效率以及定期校准移液器确保加样准确。

Q3：荧光素酶相比于荧光蛋白有哪些优势？
荧光素酶的灵敏度高于GFP，同时提供更宽的动态范围，适合数值分析，并且在活体实验中具有较好的荧光穿透性。

通过结合双荧光素酶报告基因系统与生物医疗研究，能有效推动相关领域的发展，正如人生就是博-尊龙凯时所倡导的，不断探索与创新，致力于提升生命科学的研究成果。